在药物研发与临床评价中，精准定量药物浓度是评估药物疗效和安全性的重要环节。随着生物技术的飞速发展，生物药（如单抗、多肽、寡核苷酸、小核酸、PROTAC等）和小分子化药的生物分析需求日益复杂，液相色谱-串联质谱联用技术（LC-MS/MS）凭借其高灵敏度、高特异性，已成为生物分析领域不可或缺的工具。作为覆盖临床前到临床全链条的PK/PD研究平台，阳光德美依托国际领先的质谱分析平台及符合GLP/GCP要求的实验室体系，致力于为创新药物提供精准PK/PD研究服务。本文将从技术原理与优势、技术挑战、应用案例及平台优势五方面，解析LC-MS/MS技术如何实现药物浓度的精准定量。
1.原理
液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）是一种结合了液相色谱（LC）高效分离能力和串联质谱（MS/MS）高灵敏度检测能力的分析技术。液相色谱通过流动相将复杂样品中的各组分分离，随后进入质谱仪进行检测。质谱仪通过电喷雾离子化源的电离技术对样品进行雾化电离，根据质荷比（m/z）对离子进行分析，从而实现对目标化合物的定性和定量分析。
2.优势：
（1）高灵敏度与高特异性
LC-MS/MS技术能够在复杂生物基质中检测到极低浓度的目标药物，能够检测到ng、pg，甚至fg级别。这种高灵敏度使其成为检测低丰度药物及其代谢产物的理想选择。同时质谱仪的高特异性可以有效排除基质干扰，确保检测结果的准确性。
（2）宽线性范围与高准确度
LC-MS/MS技术具有宽线性范围，能够覆盖从低浓度到高浓度的药物浓度范围。这意味着在一次分析中，可以同时检测到药物的低剂量和高剂量水平。另外通过使用同位素内标，LC-MS/MS能够显著提高定量的准确度。
（3）快速分析与高通量
LC-MS/MS技术能够在短时间内完成复杂样品的分析。LC-MS/MS的分析时间较短，且能够同时采集多个分析物的数据。这使得其在大规模临床试验和药物研发中具有显著的效率优势。
1.基质效应
基质效应是LC-MS/MS技术在生物分析中面临的主要挑战之一。基质效应是指生物基质中的成分对分析物响应的影响。生物样品中的内源性物质可能会干扰目标药物的离子化过程，导致检测结果的偏差。为解决这一问题，通常采用内标法和基质匹配校准曲线。内标法通过添加已知浓度的内标物，校正基质效应的影响。基质匹配校准曲线则通过用相同比例基质制备标准曲线，确保定量的准确性。
2.方法开发
LC-MS/MS方法的开发是一个复杂的过程。方法开发需要考虑样品前处理方法、色谱条件、质谱参数等多个因素。LC-MS/MS方法开发需兼顾灵敏度、特异性与通量，其核心挑战在于如何优化前处理方法与质谱参数。
(1). 样品前处理策略
化药：采用蛋白沉淀、液液萃取或固相萃取（SPE）富集目标化合物。例如，疏水性药物可通过增加有机相比例提升回收率。内源性药物：常用的替代基质法、替代分析物法，再结合化合物的极性与灵敏度的要求，采取不同的处理方法，减少其他内源性化合物的干扰，达到实验的目的。多肽药物：肽类生物分析通常采用的样品预处理技术主要有固相萃取、蛋白质沉淀和免疫亲和提取。而蛋白沉淀和固相萃取的结合使用，对某些多肽分析物的提取回收率有很大的帮助。抗体药物：通过酶切生成特征性肽段（替代肽段），结合亲和富集或直接沉淀法去除基质干扰。
核酸药物：液液萃取法和固相萃取法是核酸类药物生物样品制备中使用最广泛的方法，最常见的液液萃取方法是使用苯酚-氯仿提取或者是在此基础上的改进，而最常见的固相萃取方法采用与色谱分离中相似的缓冲系统。液液萃取和固相萃取的组合也是测定寡核苷酸的一种方法。核酸药物的样本前处理中非特异性吸附是核酸类分子灵敏度降低的一个更重要原因。因此，在该方法中尽量减少样品转移步骤，避免样品损失也是前处理过程中需要解决的问题。
(2). 质谱参数优化
可以采用多反应监测（Multiple Reaction Monitoring，MRM）模式提升灵敏度。MRM是一种常用于三重四极杆质谱（Triple Quadrupole MS）的多重反应监测技术，适用于同时定量多个目标化合物。它通过选择母离子和子离子对的反应进行监测，具有更高的选择性。在MRM模式下，质谱仪首先选择目标分子的母离子（Parent Ion），然后通过碰撞诱导解离生成子离子（Product Ion），并在第三个四极杆中选择并监测这些子离子的信号。可以同时监测多个目标物质的母离子和其对应的子离子对。该模式具有高灵敏度和选择性，能够同时监测多个目标物质。可以有效抑制背景干扰。但需要预先知道目标物质的母离子和子离子的反应信息。
3. 方法验证
在生物分析领域，方法验证是确保检测结果科学性、准确性和可靠性的关键环节。根据ICH M10指导原则，色谱法（如LC-MS/MS）的方法验证需要涵盖多个关键参数，以全面评估分析方法的性能。以下是这些参数的详细描述：
（1） 线性范围
线性范围是校准曲线能够准确反映分析物浓度的区间，由定量下限（LLOQ）和定量上限（ULOQ）决定。校准曲线应包括至少6个浓度水平的校正标样，覆盖从LLOQ到ULOQ的范围。在校准曲线的每个浓度水平，回算浓度应在标示值的±15%以内（LLOQ为±20%），且至少75%的校正标样需符合标准。
（2） 精密度与准确度
精密度和准确度是评估分析方法重复性和准确性的重要指标。精密度通过批内和批间变异系数（%CV）来衡量，准确度则通过质控样品的回算浓度与标示值的偏差来评估。准确度应在标示值的±15%以内，精密度不应超过15%（LLOQ准确度应在标示值的±20%以内，精密度不应超过20%）。
（3） 选择性与特异性
选择性是指分析方法在复杂生物基质中区分和测定分析物的能力。验证时需使用至少6个不同来源的空白基质，确保在分析物保留时间处无显著干扰。对于高脂和溶血基质，也需进行选择性评估，以模拟实际研究中可能遇到的样品条件。
（4） 基质效应
验证时需使用至少6个不同来源的常规基质、至少1个来源溶血基质和至少1个来源的高脂基质，分别制备低浓度和高浓度质控样品，评估其准确度和精密度。每个来源的基质中，准确度应在标示浓度的±15%以内，精密度不应超过15%。
（5） 提取回收率
提取回收率用于评估样品处理过程中分析物的损失情况。通过比较处理后的样品与未处理样品的响应值，计算回收率。该参数有助于优化样品处理方法，确保方法的可靠性和重现性。
（6） 稀释可靠性
稀释可靠性是评估样品稀释过程对检测结果影响的参数。验证时需使用与质控样品相同来源的空白基质进行稀释，确保稀释后的样品浓度在校准曲线范围内被准确测定。稀释质控样品的准确度应在标示值的±15%以内，精密度不超过15%。
（7） 稳定性
稳定性验证包括储备液、工作液、基质样品和处理后样品的稳定性。需在实际储存条件下考察分析物的稳定性，确保样品在采集、转移、处理和储存过程中浓度不变。
（8） 重进样重现性
重进样重现性用于评估样品在储存和重新进样过程中的稳定性。通过重复测定储存后的质控样品，评估其精密度和准确度，以确定处理后样品的重进样的可行性。阳光德美实验室严格遵循ICH M10指导原则，对LC-MS/MS进行全面的方法验证。通过科学严谨的验证流程，实验室确保每个分析方法的线性范围、精密度与准确度、选择性与特异性、基质效应、提取回收率、稀释可靠性、稳定性和重进样重现性均达到国际标准，从而为客户提供高质量、精准的检测服务。
LC-MS/MS技术广泛应用于生物分析、药物代谢等领域，尤其在药物浓度定量方面具有显著优势。阳光德美凭借丰富的实战经验，为各类药物提供定制化的解决方案。
1. 小分子药物的PK研究及代谢产物鉴定
（1）磷酸森格列汀片是盛世泰科自主研发的1类创新药，阳光德美快速高效地完成了PK及代谢产物鉴定研究工作，助力磷酸森格列汀片获批上市。森格列汀多个代谢产物互为同分异构体是其代谢的一大特点，同时也增加了分析的难度。健康受试者口服森格列汀后，在血浆、尿液、粪便样本中，除原型药外，共鉴定了11个代谢产物。阳光德美首先采用高效液相-三重四极串联质谱（HPLC-MS/MS），通过优化色谱条件，分离了4组互为同分异构体的代谢产物。然后运用具有高分辨率、高灵敏、高准确度等特点的四极杆-飞行时间质谱（AB TRIPLE TOFTM 5600，Q-TOF），根据采集的原型药物及其代谢产物的精确质量数的数据确定分子式；通过质谱的碎片信息解析质谱的裂解途径，进而预测结构。我们凭借着丰富的质谱解析经验，推测了森格列汀在人体内主要的代谢途径，为解释森格列汀药效研究和安全性评价的物质基础提供科学依据。更多内容见《喜报：阳光德美PK/PD团队助力1类新药磷酸森格列汀片获批上市》。（2）盐酸凯普拉生片是柯菲平自主研发的1类新药（曾用名：盐酸柯诺拉赞片，H008），已正式获批上市，该创新药为钾离子竞争性酸阻滞剂（P-CAB）,用于十二指肠溃疡和反流性食管炎的治疗。阳光德美有幸参与该药物的Ia期、Ib期、Ic期、III期临床研究生物样品分析、代谢产物鉴定和DDI研究，并高效地推进了申报进程。阳光德美与柯菲平在长期的合作中，不断沟通磨合，以更高质高效的研发服务，满足柯菲平盐酸凯普拉生片项目申报上市需求。在盐酸凯普拉生片的研发过程中，阳光德美结合丰富的工作经验与技术能力，开发并验证了具有高灵敏度、高特异性的高效液相色谱-质谱/质谱（HPLC-MS/MS，Nexera HPLC-TRIPLE QUAD 5500）定量分析方法，同时对多种基质（人血浆、粪便、尿液）中凯普拉生及多种代谢产物进行分析。定量分析方法灵敏度高，定量下限低，分离度好，且用血量少，处理方法简便、快捷，分析时间短。同时还采用QTOF高效地完成了代谢产物鉴定工作。III期群体药代动力学共涉及50家医院临床研究中心，并涉及2种疾病的患者（反流性食管炎和十二指肠胃炎）。阳光德美同时对接多家医院，高效且顺利地完成了物资寄送与样品接收。更多内容见《喜报：阳光德美PK/PD团队助力盛格列汀片及盐酸凯普拉生片取得重大进展》。
2. 生物药的生物分析
（1）多肽药物的药代动力学研究
YKYY017雾化吸入剂是一款吸入型创新多肽，阳光德美参与并顺利高效地完成了YKYY017的药代动力学研究和免疫原性研究，为这一重要药物的研发进程迈出了坚实的步伐，助力YKYY017项目顺利进入临床III期。YKYY017作为鼻喷雾吸入制剂，血浆中药物浓度的检测极具挑战。阳光德美采用液质联用仪（Triple Quad 7500）开发并验证了高特异性、高灵敏度的定量分析方法检测血浆和尿液中的药物浓度，应用液液萃取法进行样品前处理，操作简单、节约成本；同时，引入内洗外洗加强洗方法及特殊的洗脱试剂解决了残留问题。最终实现血浆方法灵敏度达10 pg/mL，尿液方法灵敏度200 pg/mL，从而实现首剂量即可获得完整PK血药浓度曲线的结果，为临床研究提供了全面、完整的数据支持。更多内容见《阳光德美助力悦康药业吸入型创新多肽YKYY017项目顺利进入临床III期》。
（2）寡核苷酸药物
注射用CT102是悦康药业研发的国内首个抗肝癌ASO药物，阳光德美借助其大小分子PK/PD研究综合性平台的优势，攻克重重困难，成功推动了其药代动力学研究，建立了可以同时检测临床血、尿、粪样品中原型药及其代谢产物的生物分析方法，同时进行免疫原性研究及PD指标的研究，并成功将方法应用于寡核苷酸药物I期及IIa期临床研究，为II期研究采血点的调整、剂量的调整提供了科学依据。更多内容见《生物分析专栏|寡核苷酸药物的药代动力学及其生物分析》。
1. 全链条服务能力
阳光德美是一家集大/小分子药物分析为一体的、覆盖临床前到临床全链条的PK/PD研究平台和生物分析平台。阳光德美拥有符合GLP、GCP要求的生物分析实验室、P2级细胞实验室和PCR实验室，依托质谱分析平台、免疫分析平台、细胞生物学平台、分子生物学平台、病理平台和中心实验室服务，可提供从组织水平、细胞水平、蛋白水平到分子水平的检测服务，可实现对大小分子创新药物PK/PD研究的全方位支撑。阳光德美专注于解决客户药代药效研究及生物分析中所遇到的挑战，为国内外客户提供国际化水准的、以临床价值和患者需求为导向的创新药项目研发服务，包括：药代动力学生物分析服务、免疫原性生物分析服务、药效学和生物标志物研究服务、病理检测服务、定量药理学研究服务和中心实验室服务。
2. 国际标准的质量体系
实验室的质量体系是确保检测结果科学性、准确性和合规性的关键。阳光德美实验室凭借其卓越的质量管理和技术实力，建立了符合国际标准的质量体系，为客户提供高质量、可靠的检测服务。阳光德美遵循GLP/GCP规范以及ICH、FDA和CFDA指导原则，已通过了中国合格评定国家认可委员会（CNAS）的认证，并积极参与国内外权威机构组织的能力验证项目，涵盖质谱、化学发光、酶联免疫、临床检验和病理等多个技术平台，并均取得了优异的成绩，显示出卓越的检测能力和质量控制水平。
LC-MS/MS技术以其无可替代的精准性与灵活性，正推动药物研发进入“分子级”定量时代。阳光德美凭借深厚的技术积淀与全链条服务能力，致力于为全球药企提供从方法开发到申报支持的一站式解决方案。如需了解更多LC-MS/MS技术细节或定制化服务方案，欢迎联系阳光德美生物分析团队！
